viernes, agosto 31, 2007

Embrio-manía: Congelación de embriones de ratón.


(Idea para la sintonía fusilada del blog de Shora)

¡Hola amigos!

Hoy vamos a aprender a congelar embriones de ratón, de una forma rápida, (congelación ultrarápida), sencilla y para toda la familia.
Este sistema tiene la ventaja de ser más rápido que la congelación convencional (10 minutos en lugar de dos horas) y además evita tener que disponer de un biocongelador. El principal inconveniente es que solo puede utilizarse en células relativamente pequeñas, por lo que suele utilizarse para estadío de mórula compactada, es decir, en embriones obtenidos en dia 3 por la tarde, considerando dia 1 el de la aparición de tapón vaginal, que es el diagnóstico de gestación que se utiliza en ratones: El semen del macho tiene una última fracción pegajosa que se compacta formando un tapón en la vagina de la hembra, que puede ser visible a la mañana siguíente de la cópula.

Necesitaremos los siguientes materiales:

Hembras de ratón
Machos de ratón
HCG (Gonadotropina coriónica humana)
PMSG (Gonadotropina coriónica equina)
Mechero de alcohol
Papel absorbente
Etanol al 90%
Material quirúrgico (Tijeras normales y de punta fina, dos pinzas de diente y dos pinzas de punta fina)
Lupa binocular
Pipetas pasteur de vidrio siliconizado
Sistema de tubos para manejar los embriones en la pipeta.
Placas petri de 35mm
Medio M2 atemperado en pletina caliente a 37ºC
Aguja hipodérmica fina (nº)
Hialuronidasa.
Medio de congelación.
Medio de descongelación
Pajuelas
Empajuelador
Banco de nitrógeno líquido
Caja aislante con nitrógeno líquido
Gradilla
Lámina de metal de 2mm de grosor

PASO 1: SUPEROVULACIÓN PARA OBTENER EMBRIONES EN ESTADÍO DE MÓRULA
-Horario del animalario: La luz se enciende a las 7:00 y se apaga a las 21:00. Este paso es fundamental, para acoplar el ritmo hormonal diario de las ratonas al que nosotros le vamos a imponer.
-Inyección intraperitoneal de PMSG a las 15:00 del dia -2
-Inyección intraperitoneal de HCG a las 15:00 del dia 0
-Se colocan con los machos ese mismo día 0, apareciendo el tapón el dia 1 por la mañana
-Sacrificio de las hembras el dia 3 a partir de las 17:00. Los embriones se encuentran en la unión uterotubal, por lo que será necesario lavar oviducto y cuerno uterino de cada lado.

PASO 2: PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CONGELACIÓN
-Se utiliza el mismo medio con el que se recojan los embriones (Normalmente M2). Se le añaden crioprotectores penetrantes (alcoholes de bajo peso molecular, como el glicerol o el etilenglicol) y no penetrantes (macromoléculas que recubren al embrión y ayudan a su deshidratación, como la sacarosa, la albúmina sérica bovina o el suero fetal bovino.
-Un ejemplo sería, sobre M2:
· 5% de suero fetal bovino
· 0,25M de sacarosa
· 3M de etilenglicol.
-Se esteriliza por filtración, y antes de utilizarlo hay que agitarlo, porque el etilenglicol tiene tendencia a decantarse y pegarse a las paredes del frasco. Se conserva durante un mes en refrigeración, aunque es mejor que tenga el menor tiempo posible.



PASO 3: PREPARACIÓN DEL MEDIO DE DESCONGELACIÓN
-Es PBS con un 5% de suero fetal bovino, pero en este caso lleva 0,5M de sucrosa. Recibe el mismo tratamiento y se comporta igual que el de congelación.

PASO 4: PROCEDIMIENTO DE CONGELACIÓN
Unos minutos antes de comenzar con el procedimiento, se coloca una chapa de aluminio de unos 2mm de grosor en una caja de poliespan llena de nitrógeno líquido, de forma que la distancia entre la superficie del nitrógeno y la chapa sea de 50mm, y se sujeta de forma que permanezca totalmente horizontal.(Mediante una gradilla o método similar)


Se coloca una gota de unos 75 µl de medio de congelación en una placa, y en ella se pipetean en el menor volumen posible 10-15 embriones. Desde ese momento se deben contar 5 minutos. Durante ese tiempo, es conveniente agitar suavemente los embriones. Estos deben contraerse por efecto de la solución hiperosmótica y flotar, para posteriormente (en unos 3min) caer al fondo, momento en el cual se puede empezar a empajuelar.



Se carga en la pajuela una gota de medio sin embriones, como de 15mm, luego 10mm de aire, luego la gota de medio con los embriones, aire de nuevo, y medio hasta llegar al fin de la pajuela. Se sella el extremo abierto mediante unas pinzas calentadas, y cuando se han cumplido los 5 minutos desde que los embriones entraron al medio de congelación, se coloca la pajuela en la plancha sobre el nitrógeno.


Las pajuelas deben permanecer 2 minutos en la plancha, y luego sumergirse en el nitrógeno líquido. A partir de aquí, ya pueden llevarse al banco y mantenerse largos periodos de tiempo.


PASO 5:PROCEDIMIENTO DE DESCONGELACIÓN:
a) Atemperar el medio de descongelación, y echar 2ml en PBS.
b) Sacar la pajuela del nitrógeno líquido y dejar evaporar 20 segundos los vapores para que no explote al calentar.
c) Echar al baño a 37º otros 20 segundos
d) Secar la pajuela, cortar el sello apoyándola sobre el medio de descongelación, donde los embriones deben permanecer como mínimo 5 minutos, mientras se agita suavemente.
e) Lavar en M2
f) Poner en placa con microgotas de KSOM* si se va a cultivar, o transferir inmediatamente si se va a hacer esto último, pues aumenta el éxito de la operación.

domingo, agosto 26, 2007

Más sobre falocentrismo y biología.


Hace poco hablaba sobre la metedura de pata de una profesora de fisiología sobre la definición de clítoris, y lo peligrosas que son las apreciaciones sesgadas. Realmente, mi mayor asombro provenía del foro en el que se produjo tal afirmación, ya que es un hecho que la inclinación machista de la sociedad se ha proyectado en muchas areas, pero se ha cebado especialmente con la sexualidad femenina, de la fisiopatología a la sociología.

Y es que no es necesario remontarse a Freud y al origen “uterino” de la palabra histeria… es mucho más cercano que eso: Cuando alguien le explica a un niño pequeño las diferencias que existen “ahí abajo”, suele ser algo parecido a esto:

Y eso que tienes ahí es la colita. Las niñas no tienen colita sino que tienen un agujerito.

¿Encontrais algún fallo en la explicación anterior? ¿Alguien ha oido alguna vez explicarle a un niño sus genitales diciendo que él no tiene clítoris, sino que tiene una bolsa con dos bolitas? Pues es algo equivalente.

Y aquí es cuando me contradicen los observadores: “Un pene- dice esa corriente de pensamiento-es mucho mas obvio de ver que un clítoris, y esa es la razón de que se explique así” Vale. Bien. Y los dientes son mucho mas obvios de ver que las muelas, y no por eso dejas de decirle a un niño que tiene ambas cosas.

Pero es que aún hay más:

Papá pone una semillita en mamá, y esa semillita crece y crece, dentro de su tripita, hasta que cuando ya está lista, nace de ella un bebé.

¡Vivan las “mamás-maceta” enriquecidas con ADN mitocondrial!

Y es que, aún en algo que parece tan trivial, se ha anulado toda contribución materna, fuera de su papel de máquina nutricia. Un embrión se forma a partir de un zigoto, que es una célula formada por la mitad de los cromosomas de papa, y la mitad de los cromosomas de mamá. ¿Cuál es la diferencia? Pues que mamá es previsora, y pone sus cromosomas en una sola célula, llena de nutrientes, enorme, y tan protegida, que papá (que también es previsor) tiene que gastar toda su energía en hacer muchas células y muy móviles, para que al menos alguna llegue. Hasta aquí, el aporte de ambos es exactamente el mismo.

Pero será papá, y solo papá quien “decidirá” el sexo del futuro embrión (hablamos de mamíferos), ya que todos los óvulos de mama llevarán un cromosoma X, mientras que entre los espermatozoides de papá, los habrá que porten X y que porten Y.

Será mamá y solo mamá quien trasmitirá el ADN mitocondrial, que por lo tanto se propaga vía materna (abuela,madre,hija…)

Al fusionarse óvulo y espermatozoide, lo hacen también sus pronucleos, con su copia (cada uno del 50 %), del material genético del futuro embrión. La reproducción sexual ofrece muchas ventajas, como recambiar genes invalidados o estropeados, mientras que en otros casos, las dos versiones de un mismo gen pueden sufrir fenómenos de dominancia-recesividad o codominancia, para modelar el fenotipo del futuro ser vivo.

Sin embargo, ademas de reservas energéticas para los primeros estadíos del embrión, en el óvulo está tambien la “maquinaria” necesaria para aprovecharlas: las mitocondrias. Estas notables organelas no dependen completamente del nucleo para su replicación, sino que viajan con su propio material genético, y pueden dividirse con independencia de la célula a la que pertenecen, probablemente por su origen (Teoría endosimbionte de Lynn Margulis)

Dado que este material genético se trasmite íntegro de un progenitor (la madre) es muy adecuado para rastrear orígenes de especies, ancestros comunes y migraciones.

viernes, agosto 24, 2007

Lo que hacen algunos para ligar


De un documental de la BBC

domingo, agosto 19, 2007

Vivir sin agua



Se denomina anhidrobiosis a la capacidad de supervivencia en estado de máxima deshidratación, a consecuencia de la desecación del aire atmosférico.

Observamos este fenómeno en muchos animales acuáticos de pequeño tamaño (nematodos, rotíferos beloides, tardígrados de agua dulce y terrestres…) que poseen la capacidad de entrar en un estado de anhidrobiosis en cualquier estadío del ciclo vital, o solo durante ciertas fases vitales, como sucede con los huevos de cladoraceas (pulgas de agua), las larvas de algunas moscas, los quistes embrionarios de los celenterados, etc.

En el caso de los embriones enquistados de Artemia, uno de los casos mejor estudiados, vivir desecado no significa que no persista ninguna molécula de agua. Las proteínas y otras moléculas son capaces de preservar lo que se denomina “agua estructural”, es decir: Moléculas de agua que quedan atrapadas en las estructuras de otros compuestos, o forman parte de uniones adhesivas y cohesivas. Este fenómeno se favorece en condiciones de alta humedad ambiental, pero aún así, las formas anhidrobióticas contienen menos de un 2% del agua que poseen en estado hidratado.

La característica mas sorprendente de este estado vital, es que desaparecen temporalmente los signos de actividad metabólica: Estas formas dejan de consumir O2, y de acumular productos de desecho. Pero en un momento dado, en condiciones favorables, el organismo puede reanudar el metabolismo y “volver a la vida”.

En estos organismos, es frecuente la acumulación de un disacárido denominado trehalosa, que impide que la deshidratación desestabilice las estructuras celulares vitales: membranas, macromoléculas…

Los animales en estado de anhidrobiosis son capaces de tolerar muchas condiciones extremas, además de la deshidratación. Y este estado puede mantenerse durante muchos años. Supone una estrategia evolutiva enormemente útil, ya que estos animales pueden ser transportados por corrientes de aire hacia otros lugares donde las condiciones sean mas favorables, y una vez allí, establecer una nueva colonia al caer en el agua.