viernes, agosto 31, 2007

Embrio-manía: Congelación de embriones de ratón.


(Idea para la sintonía fusilada del blog de Shora)

¡Hola amigos!

Hoy vamos a aprender a congelar embriones de ratón, de una forma rápida, (congelación ultrarápida), sencilla y para toda la familia.
Este sistema tiene la ventaja de ser más rápido que la congelación convencional (10 minutos en lugar de dos horas) y además evita tener que disponer de un biocongelador. El principal inconveniente es que solo puede utilizarse en células relativamente pequeñas, por lo que suele utilizarse para estadío de mórula compactada, es decir, en embriones obtenidos en dia 3 por la tarde, considerando dia 1 el de la aparición de tapón vaginal, que es el diagnóstico de gestación que se utiliza en ratones: El semen del macho tiene una última fracción pegajosa que se compacta formando un tapón en la vagina de la hembra, que puede ser visible a la mañana siguíente de la cópula.

Necesitaremos los siguientes materiales:

Hembras de ratón
Machos de ratón
HCG (Gonadotropina coriónica humana)
PMSG (Gonadotropina coriónica equina)
Mechero de alcohol
Papel absorbente
Etanol al 90%
Material quirúrgico (Tijeras normales y de punta fina, dos pinzas de diente y dos pinzas de punta fina)
Lupa binocular
Pipetas pasteur de vidrio siliconizado
Sistema de tubos para manejar los embriones en la pipeta.
Placas petri de 35mm
Medio M2 atemperado en pletina caliente a 37ºC
Aguja hipodérmica fina (nº)
Hialuronidasa.
Medio de congelación.
Medio de descongelación
Pajuelas
Empajuelador
Banco de nitrógeno líquido
Caja aislante con nitrógeno líquido
Gradilla
Lámina de metal de 2mm de grosor

PASO 1: SUPEROVULACIÓN PARA OBTENER EMBRIONES EN ESTADÍO DE MÓRULA
-Horario del animalario: La luz se enciende a las 7:00 y se apaga a las 21:00. Este paso es fundamental, para acoplar el ritmo hormonal diario de las ratonas al que nosotros le vamos a imponer.
-Inyección intraperitoneal de PMSG a las 15:00 del dia -2
-Inyección intraperitoneal de HCG a las 15:00 del dia 0
-Se colocan con los machos ese mismo día 0, apareciendo el tapón el dia 1 por la mañana
-Sacrificio de las hembras el dia 3 a partir de las 17:00. Los embriones se encuentran en la unión uterotubal, por lo que será necesario lavar oviducto y cuerno uterino de cada lado.

PASO 2: PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CONGELACIÓN
-Se utiliza el mismo medio con el que se recojan los embriones (Normalmente M2). Se le añaden crioprotectores penetrantes (alcoholes de bajo peso molecular, como el glicerol o el etilenglicol) y no penetrantes (macromoléculas que recubren al embrión y ayudan a su deshidratación, como la sacarosa, la albúmina sérica bovina o el suero fetal bovino.
-Un ejemplo sería, sobre M2:
· 5% de suero fetal bovino
· 0,25M de sacarosa
· 3M de etilenglicol.
-Se esteriliza por filtración, y antes de utilizarlo hay que agitarlo, porque el etilenglicol tiene tendencia a decantarse y pegarse a las paredes del frasco. Se conserva durante un mes en refrigeración, aunque es mejor que tenga el menor tiempo posible.



PASO 3: PREPARACIÓN DEL MEDIO DE DESCONGELACIÓN
-Es PBS con un 5% de suero fetal bovino, pero en este caso lleva 0,5M de sucrosa. Recibe el mismo tratamiento y se comporta igual que el de congelación.

PASO 4: PROCEDIMIENTO DE CONGELACIÓN
Unos minutos antes de comenzar con el procedimiento, se coloca una chapa de aluminio de unos 2mm de grosor en una caja de poliespan llena de nitrógeno líquido, de forma que la distancia entre la superficie del nitrógeno y la chapa sea de 50mm, y se sujeta de forma que permanezca totalmente horizontal.(Mediante una gradilla o método similar)


Se coloca una gota de unos 75 µl de medio de congelación en una placa, y en ella se pipetean en el menor volumen posible 10-15 embriones. Desde ese momento se deben contar 5 minutos. Durante ese tiempo, es conveniente agitar suavemente los embriones. Estos deben contraerse por efecto de la solución hiperosmótica y flotar, para posteriormente (en unos 3min) caer al fondo, momento en el cual se puede empezar a empajuelar.



Se carga en la pajuela una gota de medio sin embriones, como de 15mm, luego 10mm de aire, luego la gota de medio con los embriones, aire de nuevo, y medio hasta llegar al fin de la pajuela. Se sella el extremo abierto mediante unas pinzas calentadas, y cuando se han cumplido los 5 minutos desde que los embriones entraron al medio de congelación, se coloca la pajuela en la plancha sobre el nitrógeno.


Las pajuelas deben permanecer 2 minutos en la plancha, y luego sumergirse en el nitrógeno líquido. A partir de aquí, ya pueden llevarse al banco y mantenerse largos periodos de tiempo.


PASO 5:PROCEDIMIENTO DE DESCONGELACIÓN:
a) Atemperar el medio de descongelación, y echar 2ml en PBS.
b) Sacar la pajuela del nitrógeno líquido y dejar evaporar 20 segundos los vapores para que no explote al calentar.
c) Echar al baño a 37º otros 20 segundos
d) Secar la pajuela, cortar el sello apoyándola sobre el medio de descongelación, donde los embriones deben permanecer como mínimo 5 minutos, mientras se agita suavemente.
e) Lavar en M2
f) Poner en placa con microgotas de KSOM* si se va a cultivar, o transferir inmediatamente si se va a hacer esto último, pues aumenta el éxito de la operación.

3 comentarios:

Illuminatus dijo...

Y todo eso así, sin guantes, ni medio esterilizado ni nada... Como quieran hacer algo de RNA con ese material va a ser una auténtica risa...

Caracol Asesino dijo...

Jejejeje me ha gustado mucho, con banda sonora incorporada.

Te ha faltado decir eso de:"ahora el que no tenga embriones de ratón congelados, es porque no quiere".

Muy interesante.

Anónimo dijo...

Me parece genial que la ciencia se lleve a la gente a traves de la web, sobre todo si se hace de una forma tan sencilla. Enhorabuena¡¡¡ Debo contestar a Illuminatus, lo siento si entramos en debate pero las manos que se ven son las mias¡¡¡ ¿Sabes que cuando se utilizan embriones para RNA no se hace así? Este protocolo permite elaborar un banco de recursos genéticos. Se pretende que el embrion, tras la descongelación, sea transferido a hembras pseudogestantes para que sea gestado. Si quieres mas detalles hazmelo saber.